技術(shù)。這個(gè)當(dāng)年名聲大噪的技術(shù)，現(xiàn)今依舊熱度不減，尤其是我們的CRISPR大神張鋒，近期發(fā)表的文章頻頻亮相于知名雜志，又引起一片熱議。時(shí)過(guò)境遷，CRISPR技術(shù)并沒(méi)有銷聲匿跡，一直在線。但任何事物包括技術(shù)

　　火了四年之久的技術(shù)，耳熟能詳?shù)膬?yōu)勢(shì)顯而易見：摒棄了對(duì)于ES細(xì)胞的依賴，CRISPR技術(shù)實(shí)現(xiàn)了對(duì)大鼠、豬、猴、斑馬魚等多種物種的編輯；CRISPR技術(shù)依賴于Cas9和sgRNA實(shí)現(xiàn)“精準(zhǔn)”切割，簡(jiǎn)化實(shí)驗(yàn)步驟，大大縮短實(shí)驗(yàn)周期。周期短、工作量小，隨之而來(lái)的就是費(fèi)用的降低。綜上，性價(jià)比高的技術(shù)當(dāng)然當(dāng)仁不讓的會(huì)一直火。

　　CRISPR技術(shù)自問(wèn)世以來(lái)，被應(yīng)用至世界各地眾多實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行科學(xué)研究，在享受其優(yōu)勢(shì)的同時(shí)，它的弊端也是眾所周知：sgRNA與Cas9蛋白這哥倆，并不是時(shí)時(shí)刻刻都兢兢業(yè)業(yè)工作的，誰(shuí)還沒(méi)有倦怠的時(shí)候呢？本應(yīng)該精準(zhǔn)定位的sgRNA也有走眼的時(shí)候，本應(yīng)該識(shí)別標(biāo)準(zhǔn)PAM序列 的Cas9蛋白，也偶爾不走心，結(jié)果就是脫靶，影響了編輯的效率。

　　醫(yī)生治病講究對(duì)癥下藥，科研思路也不例外。找出原因解決問(wèn)題，既然是sgRNA和Cas9蛋白出現(xiàn)了毛病，那么我們就針對(duì)不同病癥采取不同方式：

　?。?）改變自我：改變sgRNA 的長(zhǎng)度，截?cái)? 端的2-3 個(gè)堿基或在識(shí)別序列前加2 個(gè)鳥嘌呤，切割活性不變， 脫靶率降低5000 倍。

　　（2）提升自我：增加sgRNA 的穩(wěn)定性。如在gRNA 中增加一對(duì)A-U 堿基配對(duì)等方法。此外， 有研究表明Cas9 直系同源酶對(duì)某些位點(diǎn)的特異性較SpCas9 高，這無(wú)疑為提高特異性提供了一條新思路。

　　專一性對(duì)于家庭是很重要，而對(duì)于CRISPR技術(shù)也是很重要。專一性一方面與自身有關(guān)，另一方面也與環(huán)境的誘惑有關(guān)，因此對(duì)于Cas9蛋白，我們要從內(nèi)和外兩個(gè)因素去考慮。

　　（1） 擦亮眼睛，辨認(rèn)出誰(shuí)是你的Mr/Mrs Right：增強(qiáng)Cas9 蛋白對(duì)標(biāo)準(zhǔn)PAM 序列的識(shí)別能力，突變體D1135E對(duì)標(biāo)準(zhǔn)PAM 的識(shí)別更加特異，從而降低因識(shí)別非標(biāo)準(zhǔn)PAM 序列而引起脫靶。

　　（2）與對(duì)的人相親相愛就好，不要老是沾花惹草：將Cas9蛋白進(jìn)行定點(diǎn)突變形成eSpCas9和SpCas9-HF1，突變體減弱了Cas9 蛋白與DNA 的非特異性結(jié)合的能力，增強(qiáng)靶向序列與Cas9 蛋白結(jié)合的競(jìng)爭(zhēng)力。

　　（3）減少外界誘惑：調(diào)控Cas9 蛋白在細(xì)胞中的表達(dá)量。通過(guò)使用誘導(dǎo)型啟動(dòng)子、插入4-HT 依賴的內(nèi)含肽等方法構(gòu)建誘導(dǎo)型Cas9 蛋白，減少基因組暴露于Cas9 與sgRNA 復(fù)合體的時(shí)間， 即減少Cas9 與非靶向序列的結(jié)合概率，進(jìn)而降低脫靶率。

　?。?）斷舍離：僅保留其核酸識(shí)別能力，斷除其核酸內(nèi)切酶的活性。當(dāng)然對(duì)于自身也是必須的：降低HNH 或RuvC 結(jié)構(gòu)域功能的突變體H840A 和D10A；構(gòu)建使Cas9 蛋白喪失核酸內(nèi)切酶活性，借助其他核酸內(nèi)切酶實(shí)現(xiàn)基因編輯的CRISPRi和FokⅠ-dCas9。

　　對(duì)大量數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，采用ES細(xì)胞方式制備，隨機(jī)插入概率約為20%，采用CRISPR/Cas9技術(shù)，大約有32%的概率有隨機(jī)插入。而這32%中有14%的隨機(jī)插入無(wú)法依靠交配傳代去除，排除隨機(jī)插入的金標(biāo)準(zhǔn)是Southern blot。百奧賽圖嚴(yán)把質(zhì)量關(guān)，堅(jiān)持進(jìn)行Southern blot檢測(cè)，確?；蚓庉嫬@得的動(dòng)物無(wú)隨機(jī)插入。

　　Southern雜交的目的是為了檢測(cè)目的基因的插入位置及拷貝數(shù)量。Southern blot雜交是進(jìn)行基因組DNA特定序列定位的方法，其操作過(guò)程：利用電泳分離經(jīng)酶消化后的DNA片段，然后再將膠上的DNA變性并在原位將單鏈DNA片段轉(zhuǎn)移至尼龍膜或其他固相支持物上，經(jīng)干烤或者紫外線照射固定，再與相對(duì)應(yīng)結(jié)構(gòu)的DIG標(biāo)記探針進(jìn)行雜交，用放射自顯影或酶反應(yīng)顯色，從而檢測(cè)特定DNA分子的含量。

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