成簇規(guī)律間隔短回文重復(fù)序列（CRISPR）/CRISPR 相關(guān)蛋白（Cas）系統(tǒng)是目前應(yīng)用最廣泛的基因組編輯技術(shù)，利用具有核酸內(nèi)切酶功能的Cas蛋白如 Cas9和Cas12a等，用于位點(diǎn)特異性靶向DNA識(shí)別和切割。

　　那么CRISPR基因組編輯技術(shù)是什么呢？它有哪些廣泛的應(yīng)用？面臨的挑戰(zhàn)有哪些？下面一一展開揭曉。

　　當(dāng)CRISPR/Cas系統(tǒng)結(jié)合靶標(biāo)后，核酸酶催化DNA切割，產(chǎn)生DNA雙鏈斷裂（DSB），通過細(xì)胞DNA修復(fù)途徑進(jìn)行DSB修復(fù)導(dǎo)致基因修飾（編輯）的引入。

　　細(xì)胞DNA修復(fù)途徑主要包括：1. 末端連接通路導(dǎo)致短插入或缺失（插入缺失）；2. 同源定向修復(fù)（HDR）使用外源DNA修復(fù)模板用于設(shè)計(jì)精確的修改（圖1）[3]。

　　源自化膿性鏈球菌的典型 Cas9 蛋白（SpCas9）是第一個(gè)被重新用于基因組編輯的Cas核酸酶，由于其固有的高活性和特異性，仍然是使用最廣泛的基因編輯器。

　　Cas12a是一種源自V型 CRISPR-Cas 系統(tǒng)的Cas核酸酶，在Cas9幾年后被發(fā)現(xiàn)，同樣被重新用于基因組編輯。

　　CRISPR-Cas系統(tǒng)作為簡單有效的可編程基因編輯工具的重新利用極大地推動(dòng)了許多領(lǐng)域的基礎(chǔ)和應(yīng)用研究，為靶向基因療法和各種生物技術(shù)應(yīng)用的發(fā)展奠定了基礎(chǔ)。

　　然而，高度進(jìn)化的生物防御系統(tǒng)的功能特征與精確基因組編輯工具所期望的功能不同。因此，第一代基于CRISPR的基因編輯工具的應(yīng)用潛力受到幾個(gè)關(guān)鍵因素的限制，主要包括特異性、靶向范圍、需要依賴內(nèi)源性DSB修復(fù)機(jī)制來實(shí)現(xiàn)基因組編輯以及CRISPR組件的遞送受到遞送載體、靶細(xì)胞或器官組織的限制等（圖2）。

　　a.特異性：通過開發(fā)高保真核酸酶變體、化學(xué)修飾的向?qū)?RNA 和基因組編輯器核酸酶的受控表達(dá)，解決了基因組編輯器的脫靶活性；

　　b.靶向范圍：SpCas9的NGG PAM序列要求限制了可靶向基因組位點(diǎn)的范圍。使用具有替代或放寬PAM要求的Cas9工程變體、具有替代PAM要求的其他天然衍生的Cas9直系同源物和Cas12a酶來解決這個(gè)問題；

　　c.編輯結(jié)果的控制：已經(jīng)開發(fā)了各種方法，包括不對(duì)稱或系留 HDR 修復(fù)模板、細(xì)胞周期同步和 NHEJ 抑制劑，以提高 HDR 的效率并通過末端連接途徑抑制插入缺失的形成。第二代技術(shù)（如Base or Prime editing）能夠獨(dú)立于 HDR 引入精確修改。

　　d.遞送：將基因組編輯器組分穩(wěn)定運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞中需要載體，載體的技術(shù)得到了很大的發(fā)展，電穿孔/核傳染、脂質(zhì)納米顆粒和病毒載體促進(jìn)了基因組編輯器組分的細(xì)胞遞送。

　　由于CRISPR編輯技術(shù)的局限性，尤其是對(duì) DSB 的遺傳毒性的擔(dān)憂以及解決 HDR 效率低下的必要性進(jìn)一步促進(jìn)了第二代CRISPR技術(shù)的發(fā)展，該技術(shù)介導(dǎo)基因組編輯，而無需依賴于 DBS 形成和 HDR，如單堿基編輯器（Base editors, BEs）、引導(dǎo)編輯（Prime Editor，PE ）、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)CRISPRi 和 CRISPRa以及RNA 編輯技術(shù)（圖3）。

　　單堿基編輯器采用了Cas9切口酶（nCas9）與核堿基修飾酶融合技術(shù)，由可編程的DNA結(jié)合蛋白組成，如dCas 核酸酶或轉(zhuǎn)錄激活物樣效應(yīng)物(TALE)重復(fù)陣列，融合脫氨酶，將一個(gè)堿基轉(zhuǎn)換為另一個(gè)堿基，而無需雙鏈斷裂。

　　這種方法對(duì)于引入特定的點(diǎn)突變（A-to-G或C-to-T，以及A-to-C或C-to-G）特別有效，從而實(shí)現(xiàn)精確的基因校正或引入終止密碼子以進(jìn)行精確的基因敲除。

　　引導(dǎo)編輯（Prime Editor，PE）有一個(gè)引導(dǎo)編輯器(PE)蛋白，通常是一個(gè)切口酶Cas9 (nCas9)和逆轉(zhuǎn)錄酶（RT）的融合，以及一個(gè)引導(dǎo)Prime Editor的RNA (pegRNA)，pegRNA中包含single guide RNAs (sgRNAs)，在其3′-端還有一段引物結(jié)合序列（Primer binding site，PBS）和轉(zhuǎn)錄模板序列（RT template），它定位編輯目標(biāo)位點(diǎn)，在不引入雙鏈斷裂（DSB）和供體DNA模板的前提下，實(shí)現(xiàn)靶標(biāo)位點(diǎn)的插入、刪除和替換多達(dá)幾十個(gè)核苷酸的序列（圖4）[4]。

　　CRISPR技術(shù)不僅適用于基因組編輯，而且還能夠?qū)虮磉_(dá)進(jìn)行瞬時(shí)操作，如CRISPR干擾（CRISPRi）和 CRISPR激活（CRISPRa）轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)技術(shù)，通過靶向失活的Cas9（dCas9）與轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域（如 VP64 或 KRAB）融合到基因啟動(dòng)子實(shí)現(xiàn)RNA引導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)錄控制。

　　Cas9的催化失活突變體最初用于細(xì)菌靶向基因啟動(dòng)子和空間阻斷RNA聚合酶，從而抑制RNA轉(zhuǎn)錄。

　　在真核細(xì)胞中抑制基因表達(dá)，核酸酶失活的Cas9可以融合到各種轉(zhuǎn)錄和表觀遺傳調(diào)節(jié)劑，例如KRAB轉(zhuǎn)錄阻遏蛋白結(jié)構(gòu)域，以及靶向啟動(dòng)活躍轉(zhuǎn)錄基因的區(qū)域。

　　由此產(chǎn)生的方法被稱為CRIkaiyun平臺(tái)官網(wǎng)登錄 開云網(wǎng)站SPRi，可以有效地敲低基因表達(dá)，作為基于小干擾RNA（siRNA）的RNA干擾的替代品。

　　CRISPRa是通過融合dCas9 到反式激活結(jié)構(gòu)域，例如 VP64 及其衍生物實(shí)現(xiàn)。類似地，核酸酶死亡的Cas9蛋白融合可用于激活特定基因的表達(dá)，通過直接募集轉(zhuǎn)錄激活因子或調(diào)節(jié)染色質(zhì)狀態(tài)。

　　與基因組編輯不同，RNA 編輯技術(shù)利用靶向RNA的Cas13核酸酶，用于靶向轉(zhuǎn)錄本降解（當(dāng)具有催化活性時(shí)）或用于轉(zhuǎn)錄本編輯（當(dāng)催化失活并融合到腺苷脫氨酶時(shí)）。

　　CRISPR 技術(shù)通過允許科學(xué)家在各種實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭心M致病突變改變了基因研究，創(chuàng)建大規(guī)模的全基因組篩選方法，并開發(fā)合成基因記錄設(shè)備，用于研究正常發(fā)育和疾病進(jìn)展。

　　CRISPR基因組編輯從基礎(chǔ)研究和新療法的的技術(shù)進(jìn)步給促進(jìn)人類健康帶來了許多具有巨大潛力的應(yīng)用（圖5），主要包括以下幾種：

　　a.CRISPR誘導(dǎo)的基因敲除或突變：CRISPR 核酸酶、堿基編輯器和引物編輯器有助于產(chǎn)生特定的基因改變，包括培養(yǎng)細(xì)胞系和動(dòng)物中的基因敲除、敲除和靶向突變，從而能夠?qū)θ祟愡z傳疾病變異進(jìn)行建模。

　　b.CRISPR篩選：這些應(yīng)用涉及使用向?qū)NA文庫進(jìn)行高通量基因功能分析。用這些文庫轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞進(jìn)行基于選擇的測定，下一代測序用于分析細(xì)胞群中引導(dǎo)RNA的富集或耗竭，從而鑒定參與特定生物過程的基因。CRISPR 篩選可以使用 CRISPR 核酸酶、CRISPRi/a 轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)劑以及堿基和引物編輯器進(jìn)行。

　　c.體外治療性基因編輯：這些治療方法涉及在受控的實(shí)驗(yàn)室環(huán)境中對(duì)來自患者或健康供體的細(xì)胞進(jìn)行CRISPR編輯，然后將修飾的細(xì)胞（重新）引入患者體內(nèi)。

　　d.體內(nèi)治療性基因組編輯：與體外策略相比，體內(nèi)治療性基因編輯涉及通過局部或全身遞送將 CRISPR 基因組編輯器直接施用于體內(nèi)受影響的組織，靶向特定器官或組織，通常使用基于脂質(zhì)納米顆粒或病毒載體的方法。

　　許多原理驗(yàn)證臨床前研究已經(jīng)成功地證明了體內(nèi)的治療性基因組編輯，特別是在杜氏肌營養(yǎng)不良癥動(dòng)物模型中通過肌肉定向遞送 AAV9載體Cas9 和 guide RNA恢復(fù)抗肌萎縮蛋白蛋白表達(dá)的努力，并在小鼠模型中通過AAV9介導(dǎo)將CBE遞送至大腦挽救脊髓性肌萎縮癥。

　　在過去十年中，當(dāng)前CRISPR技術(shù)的局限性變得越來越明顯，新的方法和策略繼續(xù)被開發(fā)和微調(diào)，以解決這些限制，并提高基于CRISPR的基因組編輯的功效和多功能性。

　　這些新興的第三代工具和技術(shù)（圖6）包括近期發(fā)現(xiàn)的緊湊型 RNA 引導(dǎo)核酸酶，這些核酸酶已適用于基于 DSB 的編輯，也可以用于其他基因組編輯器模式（如BE和 PE）的RNA引導(dǎo)的DNA結(jié)合平臺(tái)。

　　CRISPR引導(dǎo)重組酶和轉(zhuǎn)座子的發(fā)展顯示出潛力，基于逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子和用于編輯RNA轉(zhuǎn)錄本基因組編輯技術(shù)也出現(xiàn)了新的方法，如DNA聚合酶編輯器、工程化CRISPR整合酶、靶標(biāo)引發(fā)的逆轉(zhuǎn)錄、表觀遺傳學(xué)編輯器和基因編輯中的人工智能等。

　　●DNA聚合酶編輯器：該技術(shù)將Cas9切口酶與DNA聚合酶相結(jié)合，并結(jié)合單鏈DNA模板，例如使用HUH核酸內(nèi)切酶。與引導(dǎo)編輯（PE）的一個(gè)關(guān)鍵區(qū)別在于它使用DNA聚合酶而不是逆轉(zhuǎn)錄酶，以及在反式中遞送DNA模板。

　　●CRISPR相關(guān)轉(zhuǎn)座子：這些天然存在的移動(dòng)遺傳元件利用CRISPR效應(yīng)復(fù)合物與轉(zhuǎn)座酶蛋白結(jié)合進(jìn)行RNA引導(dǎo)的轉(zhuǎn)座，將長DNA序列插入特定的基因組位點(diǎn)。

　　●工程化CRISPR整合酶：這些技術(shù)基于將引導(dǎo)編輯與位點(diǎn)特異性絲氨酸重組酶相結(jié)合。引導(dǎo)編輯最初在靶 DNA 位置引入重組酶 att 位點(diǎn)，隨后重組酶催化大 DNA 有效載荷的插入。

　　●靶標(biāo)引發(fā)的逆轉(zhuǎn)錄：該過程涉及將切口酶Cas9與非長末端重復(fù)序列（非LTR）逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子衍生的逆轉(zhuǎn)錄酶和RNA融合。它通過切開靶 DNA 來產(chǎn)生游離 3’端到逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子相關(guān) RNA 的引物逆轉(zhuǎn)錄上，從而導(dǎo)致靶向 DNA 插入。

　　●表觀遺傳學(xué)編輯器：將失活的dCas9與DNA甲基化酶和組蛋白修飾酶融合，可在特定基因組位置進(jìn)行靶向染色質(zhì)修飾，從而在不改變潛在DNA序列的情況下實(shí)現(xiàn)基因表達(dá)的遺傳性抑制（CRISPR off）?；蛟偌せ睿–RISPR on）涉及使用Cas9 與 DNA 去甲基化酶和轉(zhuǎn)錄激活因子結(jié)構(gòu)域的融合來靶向被抑制的基因。

　　●基因編輯中的人工智能：人工智能在從頭蛋白質(zhì)和指南設(shè)計(jì)以及脫靶位點(diǎn)和編輯結(jié)果的計(jì)算預(yù)測方面取得了重大進(jìn)展。

　　基因組編輯技術(shù)歷經(jīng)幾代的發(fā)展，目前CRISPR/Cas系統(tǒng)是應(yīng)用最廣泛的，盡管CRISPR基因組編輯存在局限性，但是它的未來是光明的。它不僅有可能推動(dòng)研究突破和徹底改變?nèi)祟愥t(yī)學(xué)，而且還有可能加強(qiáng)農(nóng)業(yè)和解決生態(tài)問題，從而為子孫后代創(chuàng)造更健康、更可持續(xù)的未來奠定基礎(chǔ)。

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